茶树嘌呤生物碱主要包括咖啡碱、可可碱和苦茶碱等。苦茶碱（1,3,7,9-四甲基尿酸）是一种天然产物，具有显著的抗抑郁、镇静、催眠等药理活性，而咖啡碱（1,3,7-三甲基黄嘌呤）既是重要茶叶品质成分，又有一些特殊人群对它非常敏感。因此，培育高苦茶碱和/或低咖啡碱的茶树品种将增加茶的健康益处并促进消费。然而，茶树咖啡碱与苦茶碱的合成及调控机制尚未充分阐明，相关的优异基因未能得到充分发掘利用。

近期，JCR 园艺学Top1期刊Horticulture Research在线发表了我所茶树种质资源创新团队题为“A novel TcS allele conferring the high-theacrine and low-caffeine traits and having potential use in tea plant breeding”（论文1）和“Deeply functional identification of TCS1 alleles provides efficient technical paths for low-caffeine breeding of tea plants”（论文2）的研究论文。

研究人员先通过无苦茶碱‘中茶302’(ZC302)和富含苦茶碱特异资源‘乳源苦茶’(RY)人工杂交构建了超过180个个体的F1群体，后又以其中的高苦茶碱F1单株为父本构建了多个人工杂交群体。研究发现，F1个体的苦茶碱含量与咖啡碱含量呈高度负相关（R2 >0.9），高苦茶碱个体与无苦茶碱个体呈1：1分离。混合分组转录组测序、分子标记定位和基因表达分析表明苦茶碱合成酶(TcS)基因是决定高苦茶碱性状的关键候选基因，并通过稳定遗传转化烟草进一步明确了TcS的功能。在30份具有广泛遗传背景的茶树资源中，仅8份资源含有TcS基因。体外酶活性测定表明‘RY’中TcS编码的蛋白酶活性较高，并进一步利用突变实验证明了第241个氨基酸是TcS的关键残基。与其他资源相比，‘RY’的TcS启动子存在着234 bp的缺失和271 bp的插入，GUS组织化学分析和双荧光素酶活测定结果均表明‘乳源苦茶’中的TcS启动子活性相对较高。基于“TcS启动子271 bp的插入”开发了一个功能标记，它与‘RY’的F1群体和F2群体中的高苦茶碱个体均共分离。上述研究结果表明，新的TcS等位基因导致‘RY’及其子代形成了高苦茶碱、低咖啡碱性状。

图1 高苦茶碱功能标记的开发与验证

茶树咖啡碱合酶(TCS1)是咖啡碱生物合成途径中最关键的N-甲基转移酶（NMT），它催化N-3和N-1的甲基化。参与咖啡碱与可可碱等嘌呤生物碱生物合成的NMTs存在着独立进化机制，这使得TCS1有着多样的序列变异。除了先前发现的8种TCS1等位变异外，论文2在673份茶树种质资源中鉴定出了新的等位基因TCS1h。体外活性分析结果表明，TCS1h同时具有可可碱合酶(TS)和咖啡碱合酶(CS)活性，通过点突变实验明确除第225位氨基酸残基外，其第269位氨基酸残基也决定CS的活性高低。研究发现咖啡碱、苦茶碱等的含量与相应功能基因和等位基因的表达有关，基因表达的有无和水平的高低在很大程度上决定了茶树中嘌呤生物碱的含量。通过GUS组织化学分析和双荧光素酶检测表明TCS1e和TCS1f的启动子活性明显较低，并进一步通过缺失突变及点突变实验确定了一个关键的顺式作用元件(G-box)。综合本研究及前期的研究结果，将已发现的9种TCS1等位基因分为三种功能不同的类型（只有TS活性、有TS和CS活性但转录水平较低、有TS和CS活性且转录水平较高），并在多年的种质创新实践基础上提出了低咖啡碱育种的技术路径(图2)。

图2 三种低咖啡碱茶树育种技术路径

上述研究结果将有助于深入了解低咖啡性状和高苦茶碱性状形成的遗传基础，开发的功能标记将加快品种培育的速度，为选育高苦茶碱和/或低咖啡碱茶树品种提供了理论与技术支撑和优异基因资源。

我所茶树种质资源创新团队金基强副研究员与姚明哲研究员为论文1的共同通讯作者，已毕业硕士生钟红，硕士生王熠、璩馥榕为共同第一作者。金基强副研究员与陈亮研究员为论文2的共同通讯作者，硕士生王熠与已毕业硕士生刘玉飞为共同第一作者。相关研究在国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、浙江省农业新品种选育重大科技专项、财政部和农业农村部：现代农业产业技术体系建设专项资金、中国农业科学院科技创新工程等项目的资助下完成。

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